Entrevista Dra. Norma Laura Delgado Buenrostro


Entrevista Dra. Norma Laura Delgado Buenrostro

Microscopía en las Ciencias Biológicas

El avance de las ciencias biológicas sería impensable sin la invención del microscopio, equipo indispensable en casi todos los laboratorios biomédicos actuales. Sin embargo, en los últimos años, la biomedicina se ha visto colmada de una incorporación de modelos matemáticos para explicar el comportamiento de los genes y, a partir del desciframiento del genoma humano, contamos con explicaciones de las enfermedades a un nivel genético, proteico, o metabólico. Todos estos eventos han llevado a suponer que la aparición de una biología “seca”, donde los modelos matemáticos por computadora predecirán la respuesta a determinados fármacos o la evolución de la enfermedad. Pero, en este mundo cambiante, ¿cómo se incluye la microscopia? ¿Debemos olvidarnos de ese aliado del desarrollo científico que ha sido el microscopio óptico? ¿Qué aportes podemos esperar de esta área del conocimiento en nuestro trabajo diario? 

En esta ocasión, pedimos a una experta en el campo que nos respondiera una entrevista al respecto. La Dra. Norma Laura Delgado Buenrostro, es Química Farmacéutica Bióloga por parte de la FES-Cuautitlán, UNAM. Cuenta con maestría y doctorado en ciencias por el CINVESTAV, en Biología Celular. Desde hace 29 años es académica en la FES Cuautitlán-UNAM, realiza investigación en la FES Iztacala-UNAM, y es miembro del Sistema Nacional de Investigadores con nivel 1. La Dra. Delgado cuenta con una amplia experiencia en el campo de la microscopia óptica, además del desarrollo de técnicas de obtención y preparación de especímenes para este campo. Para nosotros ha sido un honor hacer esta entrevista, esperando que ustedes también la disfruten. 

MedLab. ¿Qué importancia tiene la microscopia óptica en el área de las ciencias biológicas? 

Dra. Delgado. El microscopio óptico desempeña un papel muy importante en la investigación biológica. Todos sabemos que con la ayuda de un microscopio óptico primitivo, Schleiden y Schwann describieron por primera vez células aisladas (la unidad fundamental de la vida); sin embargo, hoy en día el conocimiento detallado de la arquitectura celular, se basa en varios tipos de observación por el microscopio, sobre todo porque no hay una única visión correcta de cómo se enfoque una célula. Es, por tanto, muy importante comprender las características de las técnicas que nos permitan observar células con diferentes fondos o alguna tinción con que fueron tratadas. Los tipos de imágenes que se producen y las limitaciones que se presentan dependen del tratamiento que se les dio a las células analizadas. Es decir, el desarrollo de la microscopía ha extendido la capacidad de resolver estructuras sub-celulares y ha producido una gran cantidad de información nueva acerca de la organización de los tejidos. Actualmente los avances en la construcción de los microscopios ópticos, se han basado en el perfeccionamiento de la óptica, en la iluminación y en la obtención de imágenes en 3D con una excelente resolución.   

MedLab. En su desarrollo académico, ¿qué la llevo a dedicarse en el área de la microscopia óptica? 

Dra. Delgado. He sido docente más de 33 años y en el comienzo de mi desarrollo laboral, en cada materia que impartía, era hacer uso de un microscopio óptico. La vida me ha llevado de la mano con la microscopia óptica, ya que obteniendo el doctorado en el 2005 me contrataron en la FES-Iztacala para una plaza de carrera que involucra el uso y manejo de un microscopio confocal. 

MedLab. Actualmente existen distintos tipos de microscopio, pero la gran parte de nosotros desconocemos para que se utilizan cada uno de ellos: ¿Es lo mismo utilizar un microscopio de campo claro que uno de contraste de fases, o uno de contraste de interferencia diferencial (DIC)-Nomarski, o uno de fluorescencia? Estos tipos de microscopias, ¿tienen algo en común? 

Dra. Delgado.
Efectivamente todos ellos tienen algo en común, son microscopios ópticos. Todos cuentan con: 1) Sistema de iluminación: que corresponde a la fuente de luz y sus aditamentos (condensador) para iluminar eficientemente la preparación. 2) El sistema óptico: formado por una serie de lentes de vidrio en los objetivos y oculares que agrandan la imagen (objetivos y oculares). Y, 3) El sistema mecánico: formado por engranes y botones que permiten realizar el movimiento y cambios de las lentes para el enfoque de la preparación (platina y revolver). Sin embargo, ¿qué los hace tan diferentes, en cada caso?, pues la incorporación de un nuevo aditamento o elemento. Por ejemplo el microscopio de campo claro es el más utilizado en el área biológica, y se emplea en cortes de tejidos finos y células aisladas; en cualquiera de estos dos tipos de muestras, estas deben estar previamente fijadas y teñidas. 

Por otro lado, si nosotros le añadimos un nuevo aditamento al microscopio óptico de campo claro (como un anillo de fases), lo podemos convertir en un microscopio óptico de contraste de fases, que permitiría ver a las células con gran contraste con respecto a un campo menos brillante; este microscopio es muy utilizado en muestras de células vivas sin necesidad de fijar o teñir. Otro ejemplo: si le añadimos al campo claro un filtro polarizador en el condensador y otro en el objetivo, además un prisma de Wollaston, obtendremos como resultado los relieves que forman la imagen, los cuales son el producto de la interferencia de 2 rayos de luz en diferente fase; esta modificación es la innovación en un microscopio de contraste de interferencia diferencial (DIC)-Nomarski. Por otro lado, si al campo claro le añadimos un filtro que forma un cono hueco de luz entre el objetivo y el condensador, las estructuras celulares presentarán variación en su índice de refracción y producirán contraste en material no teñido. La imagen final resultante, presentará brillo en un campo oscuro; a esto nosotros le llamamos microscopio de campo oscuro.
Pero, además, si a este último microscopio le añadimos una lámpara de mercurio o una LED y teñimos la muestra celular con fluorocromos que emiten luz (radiación intensa) -es decir absorben una luz de una longitud de onda (λ) determinada y emiten otra luz de mayor λ a través de la lámpara LED-, tendremos como resultado una imagen muy brillante (con diferente color, dependiendo del fluorocromo utilizado) en un campo oscuro; a esto entonces le llamamos microscopio
de fluorescencia
. Por lo tanto, podemos concluir que dependiendo de las necesidades docentes y/o de investigación, tenemos que decidir qué tipo de técnica óptica debemos emplear para visualizar y obtener los mejores resultados en las diferentes muestras biológicas.

MedLab. ¿Tiene alguna relación el microscopio confocal con los mencionados?

Dra. Delgado. Toda la relación, porque también el microscopio confocal pertenece a la rama de la óptica. Imagina que como investigador tienes en tu laboratorio un microscopio de fluorescencia y a ese mismo le añades otros aditamentos como: a) otra fuente de luz además de la LED, como un láser, b) un diafragma micrométrico «Pinhole o rejilla» el cual no permite que entre más luz de la que te deja entrar la lámpara LED. c) Un scanner y sistema de barrido, además, d) fotodetectores de fluorescencia que detectan el láser y, finalmente, e) un transductor foto-eléctrico y f) computadora.

El resultado final es una imagen nítida con gran resolución ya que visualiza en un solo plano del foco, mientras que la microscopia de fluorescencia abarca todo el espesor de la célula o tejido (profundidad de campo), generando una imagen borrosa. 

MedLab. ¿Qué ventajas/desventajas ofrece trabajar con el confocal en el área de las Ciencias Biológicas? 

Dra. Delgado. Presenta muchas ventajas. En este equipo se pude controlar, por ejemplo: a) la capacidad o poder resolutivo (200nm) en cortes finos o gruesos, b) realizar cortes ópticos (horizontales y verticales) en un solo plano focal, c) realizar cortes seriados y generar una reconstrucción 3D, d) realizar múltiples marcajes, e) generar imágenes digitalizadas (películas), f) cuantificaciones, solapamiento de diferentes marcajes en un solo punto y sus respectivas mediciones, g) amplificaciones de zonas específicas, y h) eliminar la luz fuera de foco, lo que genera una excelente nitidez, así como el cuidado de mantener el control de los parámetros que proporcionan la capacidad resolutiva, todo esto, entre otras ventajas que tiene el equipo. Sin embargo, viene lo triste de la historia, sus desventajas: a) no se puede resolver más en la óptica de este equipo (200nm), es su máximo poder resolutivo, b) es costoso, c) es complejo para operar, d) requiere de una alta intensidad de luz láser y, e) el manejo de los datos.                                        

MedLab. Entonces, se infiere que no cualquier persona podría utilizar un microscopio confocal, y que resulta costoso su empleo en la docencia y/o investigación hacer uso de un microscopio de este tipo. 

Dra. Delgado. Cualquier persona podría utilizar un microscopio confocal. El problema fundamental es que para poder hacer uso del equipo es necesario tomar cursos básicos de su uso y manejo: saber cómo prenderlo, emplear el software, tener conceptos de óptica y saber aplicarlos en su momento en el microscopio, porque si no, uno desperdicia el equipo y solo realizaría fluorescencia. Eso por un lado, por otro, el que se adquiera la habilidad para tomar una imagen, no significa que seamos expertos en microcopia confocal.  Se requiere reconocer cuales son las necesidades de la investigación, esto con la finalidad de poder apoyar al investigador para lograr el objetivo deseado, aplicando todos los elementos con los que cuenta el equipo y de esta manera explotarlo en su máximo para obtener imágenes con una calidad extraordinaria y puedan servir para una siguiente etapa, que es la publicación de un artículo a nivel internacional. Desafortunadamente, eso solo se adquiere con el constante uso del equipo (practica). Por otro lado, el equipo es muy costoso: El equipo básico para realizar confocal rebasa los 7 millones de pesos; es decir es un equipo denominado monofotón. Nuestras Instalaciones (Unidad de Biomedicina-FESI-UNAM), cuenta con un SP2 y un SP8 ambos de marca Leica.  Pero si nosotros requerimos mayor profundidad de campo de la muestra, por ejemplo 80 μm-1 mm (el grosor de la corteza cerebral de un organismo vivo), no podemos hacer uso de estos equipos, requerimos uno con mayor capacidad de profundidad de campo, y como ejemplo tenemos el confocal multifotónico, cuyo aditamento es la presencia del uso de fotones  (excitación por 3 fotones), que tiene las ventajas de mayor poder de penetración y mayor potencia del láser, lo que permite que la fluorescencia se cuadriplique y genere menor daño celular, además de que el poder resolutivo se vea más favorecido. La desventaja es que requerimos de un láser tipo pulsado de rubí. Imagínense, el puro láser triplica o cuadriplica el costo de lo que cuesta el confocal básico (monofotónico). Desafortunadamente los costos para servicios de mantenimiento y reparación de los microscopios confocales también son muy altos. Lo mencionado me lleva a concluir que estos equipos no son viables para la docencia, y no porque no podamos enseñar con estos equipos, sino porque el presupuesto para la docencia lo aportan las instituciones a los que estamos adscritos son los mínimos necesarios para la compra de reactivos, especialmente para las materias teórico/prácticas en las áreas biológicas. Finalmente, la adquisición de estos equipos en la investigación es gracias a proyectos que sometemos a evaluación por instituciones como el CONACyT y COMECYT por dar algunos ejemplos, los cuales para nuestra fortuna nos han sido aprobados.

MedLab. En relación a la introducción de la entrevista, como vislumbra el futuro de la microscopia: ¿Cree que el avance de la tecnología generará nuevos equipos donde desbanquen al microscopio confocal? O ¿considera que, en los laboratorios del futuro, en la investigación “seca” (donde cambie nuestra forma de hacer ciencia como hasta ahora lo hacemos, metiendo las manos y el cerebro) será aún empleado el microscopio? ¿Considera que la microscopia es una ciencia en extinción?

Dra. Delgado.
El avance tecnológico es un BOOM constante, todos los días hay algo nuevo y eso incluye a la microscopia óptica en los sistemas que lo conforman y todos los aditamentos para las diferentes técnicas, todo esto con la finalidad de aumentar el poder resolutivo de cualquier equipo que incluya a la óptica. Sin embargo, a estas alturas, considero que solo va a existir el desbanque de algún equipo óptico en el momento que el presupuesto económico docente se vea incrementado, así como para el caso de los proyectos de investigación que son sometidos por convocatorias. Desafortunadamente, nuestro país siempre está en crisis económica. Por otro lado, el microscopio confocal tampoco será desbancado debido a que este equipo está diseñado para proporcionarnos varias ventajas como lo mencionamos anteriormente, y si lo cambiamos por un equipo más potente es porque justificamos de manera tajante las necesidades de investigación que son requeridas para su avance. Es decir, si requerimos de otras necesidades de investigación en un microscopio óptico, entonces de primera instancia nos vemos en la prioridad de buscar el apoyo en otras instituciones para hacer uso de equipos más sofisticados y que a través del uso verifiquemos que cubrimos las condiciones indispensable y que son exclusivas de esa equipo para la investigación que realizamos, por ejemplo un microscopio multifotónico. O uno de fluorescencia por reflexión interna total “TIRFM”, aquí se excitan fluoroforos a menos de 200nm de longitud de onda, con lo cual y bajo ciertas condiciones más, se logra un aumento en el poder resolutivo. Este tipo de microscopia óptica es muy útil para el seguimiento de endocitosis y exocitosis, formación de adhesiones focales, localización y dinámica de proteínas de membrana.

Otra aportación en este campo es el láser blanco: presenta toda las ventajas del confocal mejorando además el poder resolutivo, tiene emisión a lo largo de todo el espectro -cosa que el confocal básico necesita de 2 o 3 láser para cubrir todo el espectro-, tiene un tiempo de vida muy largo y el gasto de energía es muy poco. Finalmente, si los grupos de investigadores de diferentes instituciones colaboramos juntos, y demostramos que con esos equipos completamos investigaciones que den un avance científico a las enfermedades como el cáncer, diabetes, enfermedades cardiovasculares, degenerativas como el Alzhéimer, etc., entonces contaremos con equipos desde los más básicos hasta los más complejos en la tecnología que siempre va a muchos metros adelante de nosotros.  

MedLab. ¿Qué les diría a los jóvenes estudiantes de pregrado para fomentar su ingreso al estudio de la microscopia? En un ambiente tan competitivo y muchas veces frustrante como es la ciencia en general, ¿Cómo alentamos a las siguientes generaciones a seguir en el área que a nosotros nos apasiona? 

Dra. Delgado.
Efectivamente el área en la que me desarrollo me apasiona, sin embargo, yo no alentaría a los jóvenes estudiantes al ingreso de la microscopía óptica, más bien yo los alentaría a que se empaparan de toda esta información para que supieran que existen estos equipos y que se puede hacer magia con las imágenes tomadas (extensión en la capacidad de resolver estructuras subcelulares así como la gran producción de información nueva acerca de una muestra biológica) y que si en algún momento de su carrera/investigación en el  área en que se desarrollan requieren del uso de un microscopio óptico sepan la gama de tecnología reciente con la que contamos para complementar una investigación y si es posible para la obtención de un avance en la ciencia.